Dados do Trabalho

Título

EFEITOS DA INIBIÇÃO DO LINCRNA-P21 SOBRE A MIOGÊNESE E A MORFOLOGIA MUSCULAR ESQUELÉTICA IN VITRO.

Introdução e Objetivo

A miogênese é o processo de formação e regeneração do músculo esquelético e alterações nesse processo podem estar relacionadas a diversos distúrbios musculares. Recentemente RNAs intergênicos não codificantes longos (lincRNAs) têm sido descritos como reguladores críticos de funções celulares em nível epigenético, transcricional e pós-transcricional. O lincRNA-p21 está envolvido em diversos processos celulares via regulação da expressão de múltiplos genes alvos; no entanto, sua expressão e efeitos no músculo esquelético são desconhecidos. Portanto, o objetivo principal do estudo é investigar o impacto da deleção do lincRNA-p21 na morfologia e metabolismo de células miogênicas in vitro, durante a miogênese. Fornecendo conhecimento adicional sobre os processos transcricional e pós-transcricional do lncRNA-p21, para estrutura muscular, bem como, descobrir características de um possível alvo terapêutico para doenças musculares e biomarcadores de desempenho físico.

Casuística e Método

Realizou-se o cultivo e diferenciação de células imortalizadas C2C12, transfectadas com siRNA (small interference RNA), e de células mioblásticas primárias de camundongos knockout para linc-p21. Nestas células foi avaliado a proliferação celular pelos métodos de marcação de células Edu positivas, e por via de contagem de células. Foi realizado um ensaio de imunofluorescência a fim de caracterizar a morfologia celular, e determinar o índice de fusão de mioblastos. Os mioblastos foram utilizados para extração de RNA e a expressão de mRNA e lncRNA por qPCR-RT foi realizada.

Resultados

Em células imortalizadas de C2C12, ocorre um aumento de 705% da expressão de lincRNA-p21 no quinto dia do processo de diferenciação. Após inibição do lincRNA-p21 através de um siRNA [25nM], foi observado uma redução de 60% de sua expressão. Essa inibição prejudicou o processo de diferenciação, dado que houve uma redução de 52% do diâmetro do miotubo formado. Análises de genes reguladores do ciclo celular não mostraram alterações significativas na expressão de Ccnb1, Cnnd1, and Cdk1; contudo, a expressão do gene p21 foi reduzida em 73% após a inibição do lincRNA-p21 no quinto dia do processo de diferenciação. Em conjunto a esse processo, houve redução de genes que atuam na regulação miogênica, como MyoD, miogenina e eMHC. Em mioblastos primários de camundongos knockout para o lincRNA-p21, um aumento de 29% foi observado na proliferação de células utilizando a câmera de Neubauer no quinto dia, e um aumento de 12% de células Edu+ no segundo dia de cultura celular, comparado com a linhagem selvagem. Em camundongos knockout para o lincRNA-p21 também foi observado um prejuízo no processo de diferenciação celular, dado que houve uma redução de 56% do diâmetro do miotubo formado. Nos mioblastos primários houve um aumento da expressão gênica, Ccnb1 (91%), Cnnd1 (141%), e Cdk1 (89%); contudo a expressão do RNA mensageiro do p21 foi reduzida em 96% no quinto dia do processo de diferenciação das células de camundongos knockout, e similarmente às células imortalizadas, houve redução de genes que atuam na regulação miogênica, como MyoD, miogenina e eMHC.

Discussão

Muitos estudos sugerem o importante papel dos lincRNAs na miogênese muscular, ao mesmo tempo em que destacam a necessidade de identificar sistematicamente lincRNAs alterados no desenvolvimento e doenças do músculo esquelético. Espera-se que outros lincRNAs relacionados ao desenvolvimento muscular sejam descobertos, e que despontem como potenciais candidatos no uso de biomarcadores de doenças, assim como no tratamento terapêutico.

Conclusão

Essas descobertas revelam o papel regulatório do lincRNA-p21 no processo da miogênese, atuando sobre a proliferação celular e impedindo a diferenciação celular, regulando genes específicos e fatores de regulação miogênica.